Farmaci Genotossici § Farmaci Cancerogeni § Carcinogenic Drugs § Genotoxic Drugs

Capitolo 2 Cancerogenesi chimica

2.1 Introduzione

Negli ultimi anni i progressi delle metodologie analitiche chi­miche e biologiche hanno permesso di chiarire soddisfacente­mente il primo passo della cancerogenesi chimica, la reazione dei cancerogeni con il DNA. L'introduzione, pur se ancora con riserve e contrasti, dei saggi di mutagenesi come indicatori del potenziale cancerogeno di una sostanza, ha fatto si che questi saggi fossero trattati in questa monografia. Una trattazione limi­tata è stata invece riservata alle attività promotrici, cocanceroge­ne e in genere favorenti, pur avendo queste spesso una parte im­portante nella cancerogenesi, perchè, mentre possiamo identifi­care con sicurezza gli iniziatori, non disponianio di metodi al­trettanto buoni per misurare queste altre attività. II metabolismo dei cancerogeni è stato invece ampliamente trattato, dato che ne attiva la maggior parte.

La cancerogenesi è un processo con molti stadi che vanno dalla reazione con il DNA alla metastatizzazione. Questi proces­si vengono sempre meglio conosciuti, ma esulano completamen­te dagli scopi del nostro lavoro. Pertanto non verranno trattati ar­gomenti anche interessanti come gli oncogéni, la crescita neo­plastica, la metastatizzazione ed i rapporti con i tessuti dell'ospi­te. Il campo dei farmaci e stato poi scelto, oltre che per indicare priorità di sperimentazione, anche perchè in esso esistono sostanze diverse per ottenere gli stessi risultati terapeutici. Gli operatori sanitari possono così avere un altro elemento che li aiuti nelle scelte intese a minimizzare il rischio genotossico dei far­maci.

2.2 Genotossicità dei composti chimici

Prima di precisare il termine "genotossico" è necessario pre­mettere la definizione del termine "genoreattivo". Si definisce così un composto capace di reagire con il DNA, intendendo con ciò qualunque tipo di interazione, dalla formazione di legami covalenti alla intercalazione, che dia luogo alla formazione di addotti o comunque a modifiche dei nucleotidi costituenti il DNA, indipendentemente dalla loro persistenza e stabilità. Per "genotossico" s'intende un composto capace di indurre o le mu­tazioni propriamente dette, a livello genico, cromosomico o ge­nomico, o altri effetti rilevabili come cambiamenti nella struttu­ra del DNA (rotture, addotti, cross-links) e/o nei processi fonda­mentali nei quali esso è coinvolto (duplicazione, ricombinazio­ne, riparazione, distribuzione dei cromosomi). Per tutti questi effetti per i quail è stato coniato il termine "genotossicita" sono stati messi a punto specifici test capaci di rivelarli. In base a questi test si definisce "agente genotossico" quella sostanza che produce una risposta positiva anche in uno solo dei test che mi­surano uno degli effetti possibili a livello del DNA/cromosoma. "Agente mutageno" propriamente detto è un composto capace d'indurre mutazioni a carico del singolo gene, del cromosoma o del genoma. Per "mutazione" s'intende qualsiasi cambiamento stabile ed ereditabile a livello genico, cromosomico o genomico non imputabile a ricombinazione e che può portare ad una mo­dificazione fenotipica osservabile [1.2.6].

Ovviamente solo le mutazioni che avvengono nelle cellule germinali possono essere trasmesse alle generazioni successive; quelle che avvengono nelle cellule somatiche sono trasmissibili solo a livello cellulare nell'individuo portatore e terminano con la sua morte. La mutazione somatica si può esprimere con un ampio spettro di effetti, dal difetto enzimatico alla morte cellu­lare, ed uno di questi effetti può essere la trasformazione neo­plastica.

Mentre la mutazione somatica richiede per esprimersi una duplicazione cellulare prima della riparazione del DNA alterato dall'agente genotossico, il passaggio dalla reazione con il DNA alla cellula trasformata capace di crescita neoplastica richiede non solo un gran numero di passaggi, determinati da una serie di interazioni umorali e cellulari, ma anche la coincidenza di una serie di eventi che rendono fortunatamente evento statisticamente poco probabile la trasformazione neoplastica. La genotossicità non è quindi senz'altro la cancerogenicita ma ne è il presupposto biochimico.

Data la natura del DNA (costitutito da quattro sole basi, deos­siribosio ed acido fosforico e quindi da un numero limitato di gruppi reattivi su cui possono fissarsi le molecole genotossiche) le alterazioni del DNA saranno statistiche: si potranno avere ef­fetti genotossici anche per un numero relativamente piccolo di queste alterazioni, di cui solo una parte può determinare la tra­sformazione neoplastica. E’ questa la ragione per la quale i valori soglia dei genotossici, comparati con quelli delle sostanze semplicemente tossiche anche se potentissime, sono così bassi da portare alla conclusione che per essi, e quindi anche per i can­cerogeni non esiste soglia praticamente determinabile.

2.3 Il sistema metabolico microsomico

Il numero dei composti chimici che entrano nei sistemi metabo­lici di un organismo è relativamente piccolo. Tuttavia moltis­sime altre molecole, dette collettivamente "xenobiotici" per sot­tolineare la loro estraneità all'organismo, penetrano in esso e de­vono essere eliminate. Gli xenobiotici comprendono sia le so­stanze naturali che le sostanze sintetizzate ex novo dall'uomo. Può accadere quindi che un glucoside vegetale sia un normale metabolita per la pianta che lo ha sintetizzato mentre sarà uno xenobiotico per un mammifero. La nozione di xenobiotico è quindi relativa al tipo di organismo per i composti naturali men­tre si possono considerare xenobiotici tutti i composti sintetizza­ti artificialmente. Tuttavia il sistema metabolico microsomico partecipa anche al normale metabolismo: idrossila infatti gli ste­roidi preparandone la coniugazione e l'eliminazione ed è coin­volta nella desaturazione degli acidi grassi e nella w-ossidazione delle prostaglandine.

Gli xenobiotici vengono prima idrossilati e quindi copulati con diversi metaboliti: acido glucuronico, solfati, amminoacidi. La prima fase ossidativa determina la formazione sulla molecola dello xenobiotico, di solito poco solubile in acqua, di un punto di coniugazione con una molecola idrofila, normale metabolita. La seconda fase è quella di coniugazione, che dà allo xenobioti­co la idrosolubilità occorrente per la rimozione per via ematica e quindi urinaria.

Questi processi, conosciuti da tempo nel loro insieme, veni­vano definiti teleologicamente come processi di detossificazio­ne. In realtà si puo definire così  solo la coniugazione che prepa­ra l'eliminazione finale mentre molte delle trasformazioni meta­boliche che la precedono producono sostanze più reattive e quindi­ più genotossiche degli xenobiotici originali. Questo è partico­larmente vero per i cancerogeni, che nella stragrande maggio­ranza dei casi non sono tali ma lo diventano nell'organismo per attivazione microsomica che li trasforma in specie capaci di rea­gire con le strutture biologiche, specialmente con le macromole­cole fra cui il DNA.

2.4 Costituenti dei sistemi di detossificazione

2.4.1 Parte ossidativa

I costituenti essenziali sono i citocromi P-450, la NADPH-ci­tocromo P-450 reduttasi e la fosfatidilcolina (M. I. 5271). Degli altri enzimi particolarmente importante è l'epossidoidratasi. I componenti ossidativi si trovano prevalentemente legati alle membrane, soprattutto del reticolo endoplasmatico, mentre i si­stemi di coniugazione sono solo in parte legati alle membrane e molti di essi si trovano esclusivamente nel citosol.

Il citocromo P-450, così detto per avere a 450 nm il Massimo di assorbimento del suo complesso con l'ossido di carbonio CO, è una emoproteina di peso molecolare circa 50.000 contenente un eme legato covalentemente alla parte proteica. Forma un complesso con l'ossigeno molecolare e con il substrato (che può essere lo xenobiotico) nel quale un atomo di ossigeno viene ri­dotto ad acqua e l'altro introdotto nel substrato determinando, secondo la natura di questo, la formazione di un epossido o di un idrossiderivato:

RH + O2 + NADPH + H+ --> ROH + H2O + NADP+

II citocromo P-450 esiste in forme diverse, di cui due rappre­sentano oltre il 90% di questi enzimi. Uno di essi, il citocromo P-450 b, ha il massimo di assorbimento (del complesso col CO) a 450 mµ mentre l'altro, il citocromo P-450 c, ha il massimo a 448 mµ e viene spesso indicato come P-448. Sono forme geneti­camente differenti ed hanno una diversa specificità d'azione e non di substrato. Il primo idrossila gli atomi di azoto delle am­mine aromatiche o alifatiche, il secondo idrossila o epossida gli anelli aromatici.

La NADPH-citocromo P-450 reduttasi fomisce gli elettroni per la riduzione di Fe+++ a Fe++ dopo che il substrato si è legato al citocromo P-450 permettendo così la formazione del comples­so con l'ossigeno. E’ un enzima che contiene FMN e FAD (M. I. 8099).

La fosfatidilcolina è componente indispensabile del comples­so enzimatico, pur non avendo alcun ruolo nel trasporto degli e­lettroni dato che può essere sostituita da altri lipidi e persino da detergenti. La sua funzione consiste nel formare uno schermo idrofobico (water shielding) per a1cune strutture del citocromo P-450, facilitando il suo legame con i substrati meno idrosolubili ed indirettamente il trasferimento di elettroni dalla reduttasi.

L'epossidoidratasi è un enzima di peso molecolare circa 50.000 che catalizza l'idratazione degli epossidi, sia aromatici che alifatici, trasformandoli in dioli. Anche della epossidoidrata­si esistono almeno due forme di differente specificità di substra­to.

Il citocromo b5, associato nelle membrane al citocromo P­-450, è un vero citocromo che fomisce il secondo elettrone ne­cessario per l'attivazione dell'ossigeno nel complesso substrato­-ossigeno-citocromo P-450.

Un componente particolare del reticolo endoplasmatico è una monossigenasi contenente flavina: è l'unica idrossilasi a flavina dei mammiferi. Forma prima un complesso con il NADPH che lega e attiva l'ossigeno molecolare; a questo complesso si lega il substrato che viene quindi idrossilato con liberazione di acqua e di NADP¯. Mentre il sistema P-450 è normalmente in stato quiescente e per funzionare deve prima legare una molecola di substrato, la monossigenasi a flavina è sempre "carica" nella forma perossido-NADP¯ ed è quindi capace di agire immedia­tamente su molti substrati e specialmente sulle dialchilammine e su alcuni tiocomposti; è inattiva sulle alchilammine primarie.

2.4.2 Parte coniugativa

Gli enzimi principali della fase coniugativa sono la UDP-­glucuroniltransferasi, la solfotransferasi e la glutationtransfera­si. A differenza delle altre transferasi, quest'ultima è particolar­mente abbondante e diffusa ma la sua attività è regolata dai li­velli di glutationreduttasi che, dal glutatione ossidato, fornisce il glutatione (ridotto) con la funzione SH da copulare con gli i­drossiderivati o direttamente con gli epossidi formati nella fase ossidativa microsomica.

2.5 Topografia cellulare

Centrifugando il supernatante mitocondriale a 100.000 g si ottiene un sedimento contenente la maggior parte dell'attività ossidativa: è costituito da minute vescicole lipidiche, dette microsomi, che sono un artefatto derivato dalla disgregazione del reticolo endoplasmatico. Contengono la maggior parte degli enzimi ossidativi ed una parte degli enzimi di coniugazione. L'esterno delle vescicole corrisponde alla faccia citoplasmatica del reticolo; all'intemo vi è la faccia luminare. I rapporti spazia­li sono quindi alterati mentre i rapporti di contiguità fra i vari enzimi sono ben conservati assieme alla parte ossidativa; inve­ce la fase di coniugazione è poco efficiente perchè mancano u­na parte degli enzimi di coniugazione e le molecole coniuganti, rimaste nel citosol.

Se da una parte ciò rende difficile la ricostruzione in vitro del metabolismo in vivo dei cancerogeni, dall'altra è vantaggiosa ai fini sperimentali della formazione degli intermedi reattivi che non vengono poi inattivati per coniugazione.

Non tutto il reticolo endoplasmatico contiene enzimi micro­somici: essi, si trovano in quello liscio mentre quello rugoso è punto di attacco dei ribosomi e luogo della sintesi proteica.

Sulla superficie citoplasmatica del reticolo si trovano il cito­cromo P-450, il citocromo b5, le citocromoreduttasi, l'ATPasi, la nucleosidepirofosfatasi e la GDP-mannosiltransferasi. Sulla su­perficie luminare vi sono il citocromo P-450 ed alcuni enzimi di coniugazione. Il citocromo P-450 si trova anche sulla membrana nucleare e sulla membrana interna dei mitocondri dalla parte della matrice.

Fra i vari componenti della parte ossidativa vi sono precisi rapporti spaziali che si traducono in una integrazione funzionale dei vari elementi. Manca invece un rapporto di questo tipo con gli enzimi di coniugazione. Le due parti del processo di detossi­ficazione sono quindi indipendenti tra loro ed è evidente che squilibri anche modesti possono aumentare molto il rischio can­cerogeno da sostanze chimiche.

2.6 Induzione enzimatica

Prima di conoscere in dettaglio il metabolismo degli xenobio­tici si era giaà osservato che la somministrazione di una sostanza aumentava le capacità di detossificazione di altre determinate sostanze. Una volta nota la biochimica microsomica, questo ef­fetto è risultato dovuto all'induzione della sintesi degli enzimi microsomici, cioè all'incremento della loro quantità e non a mo­difiche delle proprietà cinetiche degli enzimi stessi: in particola­re lo xenobiotico stimola la sintesi del citocromo P-450.

Per l'induzione in vivo occorrono da 24 a 60 ore con il massi­mo in media dopo 40-45 ore. Dopo 48 ore comincia il decre­mento dell'attività microsomica che è asintotico: occorrono in­fatti alcuni giorni perchè l'attività ritorni ai valori iniziali. L'in­duzione avviene ugualmente in cellule di coltura ed anche nel sistema isolato di sintesi proteica degli enzimi microsomici ma in questi casi il massimo di attività si raggiunge in 8-12 ore e il ri­torno ai valori iniziali è rapido e completo in poche ore.

L'induzione del citocromo P-450 è stata studiata dettagliata­mente e si è visto che cambiando la natura chimica dell'induttore si può indurre selettivamente una delle forme del citocromo P­450. Somministrando fenobarbitale si induce la sintesi del P-­450 b che idrossila le ammine, specialmente quelle aromatiche, mentre somministrando metilcolantrene si induce il citocromo P-448 che idrossila gli anelli dei composti aromatici. I composti alogenorganici inducono invece entrambe le forme dei citocromi P-450, forse perche questi composti sono tutti xenobiotici artifi­ciali che non sono mai esistiti in natura e provocano quindi una risposta intensa ed indifferenziata (solo recentemente si è trovato che bromoderivati organici come CH2Br2, CHBr3 e CHBr2Cl sono prodotti da alghe ed immersi nell'atmosfera in quantità pa­ragonabile a quelle immesse dalle industrie) (Chem. Brit. 21.6.1985, p.513. Da: Chimica Industria 67 (11) 652 (1985)). Per questo mo­tivo come induttore routinario in animali da cui devono essere preparate le frazioni microsomiche si adopera un pesticida clo­rurato commerciale l'ArocIor 1254 (M. I. 7437).

Notevole è l'induzione microsomica nei fumatori, che deter­mina un cospicuo incremento di entrambe Ie forme del P-450, data la complessità della composizione chimica del fumo di ta­bacco. L'induzione è particolarmente accentuata nella placenta delle forti fumatrici in cui l'attività microsomica aumenta di cir­ca 80 volte contro le 6-8 volte del fegato. Questo effetto del fu­mo può quindi spiegare, almena in parte, la sua azione sincance­rogena o cocancerogena con altri cancerogeni e spiegare ad e­sempio nel caso delle esposizioni lavorative la più alta incidenza dei tumori nei lavoratori fumatori [14.3].

Alcuni ceppi puri di topi sono refrattari all'induzione con conseguente notevole diminuzione dell'incidenza dei tumori da concerogeni chimici. Le notevoli differenze interdividuali nella inducibilità e nelle concentrazioni degli enzimi microsomici ri­scontrate nell'uomo hanno fatto ipotizzare anche per l'uomo una diversa suscettibilità al cancro su base genetica. Nell'uomo però le differenze di inducibilità sono molto più piccole che nei ceppi puri di topi ed inoltre è difficile determinare la precedente e variabile esposizione a sostanze chimiche induttrici.

L'osservazione che la diossina, oltre ad essere il più potente induttore microsomico conosciuto [2.17.2] sia anche capace di indurre i ceppi refrattari, ha dimostrato che l'informazione gene­tica relativa agli enzimi microsomici è presente anche nei ceppi non inducibili ma è solo più forte la sua repressione.

2.7 Differenze di organo e di specie

Il sistema microsomico più studiato è quello epatico ma prati­camente l'attività enzimatica microsomica e presente in tutte le cellule dell'organismo. Vi sono tuttavia grandi differenze quanti­tative fra i diversi organi. Il fegato è l'organo più ricco, seguito dal rene che ha un'attivita 30-40 volte inferiore. L'intestino, il polmone e la pelle hanno rispettivamente 1/60, 1/100 e 1/1000 dell'attività epatica. Nella pelle inoltre vi è solo il citocromo P­-448, il che spiega perche l'applicazione cutanea provochi tumori con gli idrocarburi policiclici ma non con le ammine aromati­che.

Nelle ghiandole surrenali vi è un sistema microsomico parti­colare: la catena di trasporto degli elettroni al citocromo P-450 è costituito da una proteina a FAD, l'adrenodoxinareduttasi e da u­na proteina non-eme ferro-solfo, l'adrenodoxina.

Gli enzimi ossidativi microsomici sono straordinariamente si­mili nelle varie specie animali e persino vegetali. Per i citocromi P-450 è stata dimostrata una reattività immunologica crociata fra due specie diverse (Y.T. Chen et al., Eur. J.Biochem. 122, 361-368 (1982)) indizio di un'antichità filogenetica facil­mente comprensibile. Ma anche per gli altri enzimi del sistema microsomico si può parlare praticamente di identità: le sequenze delle NADPH-citocromo P-450 reduttasi del maiale e del ratto dimostrano una analogia superiore al 90% (F.Vogel, L. Lumper, Biochem. J.236, 871 (1986)).

I prodotti di ossidazione sono in genere simili nelle diverse specie animali: dall'aflatossina B1 (M. I. 166), il ratto, la trota, il topo e l'uomo forrnano tutti l'8,9-epossido (R.G.Croy et al. in: Organ and Species Specificity in Chemical Carci­nogenesis. Basic Life Sciences N. 24 (Plenum Press, New York 1983) p.49-60). I cromatogrammi dei metaboliti del benzopirene ottenuti da specie diverse sono sostanzialmente sovrapponibili con solo piccole differenze quantitative (J.K. Selkirk et al., ibidem p. 283-294).

Maggiori differenze si riscontrano per la coniugazione: vi sono differenze nelle molecole coniuganti. Alcune specie aceti­lano ed altre glucuronano. Cambiando lo xenobiotico cambia anche nelle varie specie il metabolita utilizzato. Poichè nella coniugazione intervengono metaboliti normali, lo stato nutritivo, e quindi l'appono ed il livello di alcuni metaboliti, determi­na notevoli variazioni quantitative nella coniugazione, tali da influire sulla possibile incidenza di tumori.

Alla fase coniugativa concorrono quindi tanti fattori variabi­li, oltre alle differenze di specie, da rendere difficile l'estrapola­zione da una specie all'altra del pattern metabolico di coniuga­zione degli xenobiotici.

Ma vi sono anche casi in cui solo la dose determina differen­ze negli organi bersaglio, che vengono prese per differenze di specie. L'esempio più chiaro è quello che viene dalla cancero­genicità umana e animale di alcune ammine aromatiche. Nel­l'uomo si sà fin dal secolo scorso che provocano tumori vesci­cali; negli animali invece provocano tumori epatici. Su questa differenza sono state costruite molte ipotesi senza base scienti­fica, fino ad affermare che gli epatociti umani sono refrattari alla cancerogenesi da ammine aromatiche. In realtà le dosi molto più elevate impiegate negli animali determinavano effetti tossi­ci a carico del fegato, con conseguente comparsa di divisioni cellulari rigenerative. Le mitosi aumentavano enormemente la probabilita di indurre un tumore al fegato, dove, per ragioni metaboliche, si trova il più alto numero di addotti sul DNA. Le basse dosi dell'esposizione umana non determinano divisioni cellulari nel fegato, gli addotti del DNA possono essere riparati, e l'azione cancerogena si manifesta sulla vescica (epitelio con continua attività mitotica) per la riattivazione renale dei coniu­gati epatici dei cancerogeni. Infatti, in un gigantesco esperi­mento con 24.000 animali che ha permesso di usare dosi più basse che si avvicinano a quelle dell'esposizione umana, anche nei roditori si sono avuti tumori vescicali e pochi tumori epatici (D.W. Gaylor et al., Environm. Pathol. Toxicol. Oncol. 6, 127 (1985)).

2.8 I "recettori" dei cancerogeni

La caratteristica principale degli enzimi microsomici è la loro bassa specificita di substrato. Affinchè gli enzimi si leghino al substrato xenobiotico è sufficiente infatti che questo abbia carat­tere idrofobico [1.2.5], non importa poi che sia aromatico o mo­no- o poli-ciclico o alifatico. Questa bassa affinità e specificità permette agli enzimi microsomici di ossidare molecole diversis­sime per natura e per dimensioni quali sono i farmaci e gli altri xenobiotici. Una bassa affinità si riscontra anche per gli enzimi di coniugazione e questo fa si che i prodotti dell'ossidazione mi­crosomica si distribuiscano fra le membrane, gli enzimi deputati alla loro coniugazione e tutte le macromolecole con siti idrofobi­ci.

Queste considerazioni aiutano a comprendere il significato dei così detti "recettori" cellulari dei cancerogeni. Si è visto, ad esempio, che il benzopirene viene legato da proteine cellulari e si è postulato l'esistenza di recettori per il benzopirene. Le co­stanti di affinità del complesso recettore-xenobiotico sono però molto più basse di quelle dei recettori classici, come quelli degli ormoni steroidi. Si è visto poi che gli stessi "recettori" del ben­zopirene possono legare molte altre molecole purchè idrofobi­che, con affinità diverse ma sempre relativamente basse [1.2.5].

Si è visto che l'aggiunta alle cellule di piccole quantità di emina aumenta l'attività ossidativa microsomica (C.J. Omiecinski, M.R. Jucahau, "Microsomes. Drug Oxidation and Chemical Carcinogenesis". Ed. J. Coon et al. Vol. II (Acad. Press 1980) p. 969) mentre mag­giori quantità la inibiscono (N. Nemoto, S. Takayama, Gann 73, 887 (1982)). Ciò si può spiegare postulando che i "recettori" per i cancerogeni siano molecole dell'apocito­cromo P-450 capaci di legarsi con i substrati. Questo legame de­terminerebbe un cambio di conformazione della molecola dell'apocitocromo che permette la fissazione dell'emina nel sito attivo, la costituzione quindi dell'olocitocromo P-450 capace di ini­ziare l'attività ossidativa. Si tratterebbe di un sistema che per­mette un rapido intervento sugli xenobiotici senza interferire sul destino dei normali metaboliti idrofobici. L'induzione degli enzi­mi microsomici con sintesi di nuove molecole di apocitocromi P-450 continuerebbe solo se la quantità di xenobiotico fosse molto elevata o venisse ulteriormente fornito al sistema. L'apparente paradosso dell'inibizione microsomica ad alte concentra­zioni di emina si spiega ammettendo che l'emina in eccesso ste­chiometrico rispetto ai siti enzimatici si leghi, essendo un com­posto idrofobico, con i siti di combinazione degli enzimi micro­somici per i substrati xenobiotici, entrando così in competizione con quegli xenobiotici che richiedono l'ossidazione per diventare cancerogeni.

2.9 Reazioni con il DNA nucleare

S'e già detto che le specie reattive generate dalla fase ossida­tiva del metabolismo microsomico si distribuiscono fra le mem­brane, gli enzimi deputati alla loro ulteriore metabolizzazione (epossidoidratasi, enzimi di coniugazione) e tutte quelle molecole che presentano zone idrofobiche di dimensioni adatte. Se que­ste macromolecole (proteine, acidi nucleici) presentano anche a­datti gruppi chimici si potrà avere la formazione irreversibile di combinazioni chimiche cioè di addotti. Per i motivi detti [1.2.5] questa possibilità è meno facile per le piccole molecole idrosolu­bili.

Una frazione non trascurabile di detti xenobiotici attivati rea­gisce con il DNA. Il più interessato quantitativamente e il DNA mitocondriale (97-98%) (B. Weinstein, Science 209, 297-299 (1980)). Questa preferenza si spiega con la maggior abbondanza di enzimi ossidativi microsomici sulla membrana mitocondriale e con la maggior accessibilità del DNA mitocondriale rispetto a quello nucleare.

La reazione con il DNA nucleare non è uniforme. Ad esem­pio i metaboliti reattivi del benzopirene reagiscono per il 75% con il DNA linker e solo per il 25% con il DNA nucleosomico (P. L. Jack, P. Brooks, Nucleic Acids Res. 9, 5533-52 (1981)). Non si sa se questa distribuzione, accertata per il benzopi­rene, si verifichi anche per altre classi chimiche di mutageni, an­che se si può ipotizzare che l'aumento delle dimensioni moleco­lari renda meno probabile le relazioni con il DNA nucleosomico. Che le dimensioni molecolari siano un fattore importante nella relazione con il DNA è provato dalla determinazione dei siti di formazione degli addotti sulle basi. Mentre le nitrosammine, alchilanti, reagiscono con tutt'e quattro le basi in siti diversi, anche se ovviamente in prevalenza con gli atomi di azoto, le molecole di maggiori dimensioni formano addotti quasi esclusivamente con la guanina, e ciascuna con un determinato atomo[3.4]. Così il benzopirene con il gruppo amminico, il safrolo con il cheto­gruppo dell'anello pirimidinico, l'aflatossina con 1'N7 e le ammi­ne aromatiche con il C8 dell'anello imidazolico [10.2]. Vi è inol­tre la possibilità dell'intercalazione di alcune grandi molecole planari.

La persistenza degli addotti dipende dalla natura del cancero­geno e dall'efficienza del processo di riparazione del DNA. Per gli addotti del benzopirene i tempi sono relativamente lunghi: la semivita nel polmone è di 18 giorni, nel fegato di 9 (M.S. Kulkarni, M.W. Anderson, Cancer Res. 44, 97-101 (1984)). Le dif­ferenze di specie o di ceppo o di organo nel legame che i xeno­biotici attivati formano con il DNA sono solo quantitative. Rat­to, topo, trota e uomo formano tutti dall'aflatossina l'addotto in N7 della guanina (R.G.Croy et al. in: Organ and Species Specificity in Chemical Carci­nogenesis. Basic Life Sciences N. 24 (Plenum Press, New York 1983) p.49-60).

Anche per i benzopirene gli addotti sono gli stessi per tutte le specie ed organi provati (F.B. Daniel et al. Cancer Res. 43, 4723-29 (1983)). I tessuti umani sono i più attivi nel metabolizzare il benzopirene e quelli che danno la più alta pro­porzione di addotti con il DNA nucleare. Il primo dato è facil­mente spiegabile: le piccole ma costanti quantità di composti alogeno-organici a cui le popolazioni dei Paesi industrializzati sono esposte esercitano un"'induzione" sugli enzimi microsomi­ci. Una maggiore sensibilità del DNA umano ad alcuni reagenti chimici sembra indicata dall'azione dall'H202, che produce rot­ture ossidative nella catena del DNA: per la stessa dose di H202 le cellule umane presentano 10 volte più rotture del criceto e 2-4 volte più di vari ceppi di topi. Queste differenze si mantengono per linee cellulari diverse e sono quindi da considerare specie specifiche (M.E. Hoffman et al., Biochim. Biophys. Acta 781. 234-38 (1984)). Si è fatta l'ipotesi che queste differenze siano da attribuire al contenuto in ferro della cromatina ed al livello loca­le dello ione superossido [5.5].

II legame dei cancerogeni con il DNA nucleare dev'essere considerato probabilistico: ad esempio, 1'8,9-epossido dell'afla­tossina si potrà legare alla guanina in qualunque sequenza essa si trovi. La frequenza di questi legami è determinata oltre che dal­la reattività del metabolita del cancerogeno e dalla sua concen­trazione anche dall'accessibilità delle catene del DNA.

Anche se la duplicazione avviene prima della riparazione, il numero di addotti sul DNA nucleosomico coinvolto è presumibilmente molto piccolo. Ciò è suggerito dall'esperienza di indu­zione di tumori con metilcolantrene di topi ibridi con mosaici­smo isoenzimatico: tutti i tumori sviluppati indicavano una origine monocellulare (A. Tanook, K. Tanaka, Cancer Res. 42,1856-58 (1982)).

Il legame con il DNA nucleare non implica quindi automati­camente lo sviluppo della neoplasia ma, come già detto, è il presupposto. L'aumento del numero degli addotti aumenta la probabilità di modificazione di sequenze critiche del DNA e di una duplicazione prima della riparazione. Lo sviluppo del tu­more è insomma la risultante del numero degli addotti, della lo­ro distribuzione nel DNA, dell'andamento dei processi di ripa­razione e, fattore spesso trascurato, dell'indice mitotico delle cellule bersaglio. Una elevata formazione di addotti ed una len­ta riparazione ma in una cellula che non si duplica non danno origine allo sviluppo di un tumore. II fatto che gli addotti del benzopirene fossero 10 volte superiori nel fegato che nello sto­maco, organo in cui si sviluppa il tumore, in un lavoro recente veniva considerato come una inesplicabile discrepanza (BIBRA experts editorial, Food Chem. Toxicol. 22, 323 (1984)).

2.10 Sulla quantificazione del rischio genotossico

Si può rimproverare agli AA. di questa monografia di insi­nuare preoccupazioni sul rischio cancerogeno di farmaci senza mai quantificarlo. II problema è di natura multidisciplinare e può essere affrontato solo su solide basi metodologiche e sperimentali. In letteratura si trovano stime solo per alcuni inquinan­ti, pesticidi, additivi alimentari e per alcune situazioni ambientali. Per i farmaci mancano elementi sufficienti per tentare sti­me predittive. Qui si accennerà solo a due argomenti che hanno attinenza col problema proposto.

2.10.1 II "Covalent Binding Index"

Le difficoltà che si incontrano nella determinazione quantita­tiva dell'assorbimento, attivazione, coniugazione ed escrezione dei cancerogeni e quelle ancora maggiori relative all'estrapola­zione di tali dati sperimentali da una specie all'altra possono es­sere superate determinando la concentrazione del cancerogeno sul bersaglio. Dato che la formazione degli addotti stabili con il DNA è da considerare un evento critico nell'iniziazione di un processo neoplastico (E.C. Miller, Cancer Res. 38, 1479 (1978)), la dimostrazione di questo evento per un dato composto indica senz'altro la presenza di un rischio di cancerogenesi. La determinazione della concentrazione degli ad­dotti può permettere di valutare l'entita di questo rischio. In altre parole, complessi problemi di farmacocinetica e farmacodinami­ca possono essere scavalcati dato che si può "quantificare" un e­vento che di essi è la risultante finale.

La determinazione del Covalent Binding Index (CBI) è stata proposta qualche anno fa e definita, su solide basi concettuali e sperimentali, come "il numero di addotti formati per milione di nuc1eotidi somministrando la dose di una millimole di sostanza in esame per chilogrammo di peso dell'animale" (W.K. Lutz, Mutat. Res. 65,289-356 (1979)):

 

          µmoli di sostanza legata per mole di nucleotidi

CBI = ------------------------------------------------------------------

          millimoli di sostanza somministrata per kg di animale

 

Quando questo valore è molto piccolo, da 0 a 0,2, i composti non sono cancerogeni; valori fra 1 e 10 indicano cancerogeni de­boli, intorno a 100 buoni cancerogeni e fra 1.000 e 10.000 i più potenti cancerogeni.

L'uso del CBI per la stima del rischio cancerogeno è molto affidabile. Mentre non vi sono eccezioni (non si commettono cioè errori) nel distinguere la presenza dall'assenza del rischio, dato che nessun cancerogeno ha il CBI inferiore ad 1, ve ne sono pochissime per la stima della potenza cancerogena, dato che il coefficiente di correlazione fra CBI e potenza cancerogena, cal­colato per quei cancerogeni per i quali si hanno dati quantitativi, è sorprendentemente alto (W.K. Lutz in: Adv. Exp. Med. Bioi. 136. Pt B 1349-65 (1981)).

Il benzene tuttavia, un discreto cancerogeno, ha un CBI di 2. Vi sono delle giustificazioni per questo valore più basso del pre­visto:

a) le ridotte dimensioni della molecola del benzene permettono una più ampia reazione col DNA nucleosomico;

b) vi interviene la superossido dismutasi midollare;

c) il midollo osseo ha un elevato indice mitotico.

Tutti quei cancerogeni che richiedono l'attivazione metaboli­ca formano un alto numero di addotti nel fegato, anche se questo non è per l'oncogenesi l'organo bersaglio, che invece presenta di solito un numero di addotti inferiore. La sostanziale identità del DNA di tutte le cellule della stessa specie e il fatto che la reazio­ne avvenga in vari organi ci permettono di considerare, dappri­ma in senso qualitativo, la presenza di addotti sul DNA di cellu­le epatiche come indicativa di rischio oncogeno; inoltre ci con­sentono una stima quantitativa del rischio oncogeno sebbene un pò grossolana. II rapporto abbastanza costante nella distribuzio­ne degli addotti fra il DNA nucleare (2-3%) e quello mitocon­driale (97-98 %) può anche permettere, con maggior sensibilità, di determinare il numero degli addotti del DNA epatico totale. In modo alternativo, si possono isolare i nuclei degli epatociti, si può estrarre il DNA nucleare e determinare su questo il numero degli addotti.

La determinazione del CBI si esegue somministrando all'ani­male il cancerogeno in dosi non molto elevate: essendo ottenute in vivo, il suo valore comparativo con la situazione umana è na­turalmente superiore a quello degli esperimenti in vitro.

Le tecniche usate per la determinazione del CBI sono tre:

1) somministrazione del cancerogeno marcato, preferibilmen­te con C14, dato che l'inevitabile scambio del tritio diminuisce la sensibilità aumentando il fondo;

2) determinazione immunochimica degli addotti; questo me­todo, di sensibilità intermedia, ha il vantaggio di non richiedere l'uso di composti radioattivi e quindi di potersi applicare anche al monitoraggio dell'esposizione umana;

3) post-marcature del nucleoside con addotto mediante P32: è il metodo che unisce la più alta sensibilità ai vantaggi del metodo immunochimico (K. Randerath et al., Environm. Health Persp. 62, 57 (1985)).

Sarebbe opportuno che la determinazione del CBI trovasse la sua collocazione fra i saggi a breve termine, anche soltanto per accertare o escludere la presenza di un rischio oncogeno, senza tener conto, per ora, in attesa di ulteriori dati, della valutazione quantitativa della potenza cancerogena. Del resto in sede inter­nazionale la dimostrazione dell'assenza di legami con il DNA di alcuni ftalati è stata considerata un dato importante per conside­rare queste sostanze prive di rischio cancerogeno.

Per quanto riguarda le differenze di specie, sono interessanti i non molti dati del CBI attualmente disponibili (W.K. Lutz, Mutat. Res. 65,289-356 (1979)):

 

Benzopirene

AAF

Dimetil-nitrosammina

Aflatossina

Ratto

10

70

5.000

17.000

Topo

7

60

5.500

250

La differenza di specie è presente solo per l'aflatossina e cor­risponde alla notevole differenza di sensibilità alla cancerogene­si da questa sostanza fra ratto e topo.

Perchè non pertinenti al presente studio, non vengono qui de­scritti gli indici di potenza (OPI = Oncogenic Potency Index) e mutagena (MPI = Mutageny Potency Index) ed altri indici pro­posti (C. Nicolini, Biophysics and Cancer (Plenum Press, 1986) p. 142-145).

2.10.2 Sull'equivalenza di azione mutagena fra radiazioni ionizzanti e sostanze radiomimetiche

Sono stati fatti tentativi per stabilire un'equivalenza fra azione mutagena di sostanze chimicamente definite e quella delle radia­zioni ionizzanti. L'importanza di una tale equivalenza consiste nel fatto che sugli aspetti quantitativi delle azioni biologiche delle radiazioni ionizzanti si conosce molto (G.L. Gatti, F. Toffoli, Boll. Chim. Farmac. 117,64 (1978)).

E stato proposto un parametro R che indica la molarità di coppie di ioni o di radicali prodotti nell'acqua da una certa dose di radiazioni che produce un certo danno biologico divisa per la molarità della sostanza che produce un danno biologico quanti­tativamente uguale.

Un altro valore di R indica che il sistema biologico è molto sensibile all'azione mutagena della sostanza sperimentata oppu­re che la sostanza è molto attiva su quel sistema. Sono stati tro­vati valori di R scaglionati fra circa 10-1 per la trietilenmelamina (M. 1. 9481), 10-2-10-3 per il metilsolfonato metilico (M. I. 5965) e per l'estere metilsolfonico dell'icantone (M. I. 4656) e 10-3-10-4 per vari metansolfonati alchilici e a1cuni epossidi (G.L. Gatti, F. Toffoli, Boll. Chim. Farmac. 117,64 (1978)).

2.11 Identificazione dei cancerogeni

2.11.1 Epidemiologia

L'epidemiologia dei tumori presenta delle peculiarità che la rendono diversa dall'epidemiologia generale: innanzitutto il pe­riodo di latenza è lunghissimo; inoltre la malattia si osserva an­che nei controlli sia pure con differenti tipi e frequenze. Una ra­gionevole applicazione dell'epidemiologia dei tumori richiede quindi periodi di osservazione molto prolungati, anche di de­cenni, indagine limitata a tumori di tipo relativamente raro nella popolazione generale oppure, se estesa ai tumori più comuni, differenze molto grandi di incidenza fra gruppi campione e gruppi di controllo. Ne segue che è praticamente impossibile evidenziare nella popolazione generale aumenti modesti nell'in­cidenza di tumori comuni usando gruppi di consistenza ragio­nevole (migliaia di persone e non milioni) [1.1].

I risultati delle ricerche epidemiologiche sono spesso nega­tivi; ma questi hanno molto meno valore dei risultati positivi: significano solo che la sostanza o altra causa studiata non è un cancerogeno molto potente.

2.11.2 Prove su animali.

Le prove sperimentali di cancerogenesi su animali danno un risultato più direttamente trasferibile all'uomo. La sostanziale identità del metabolismo ossidativo microsomico e delle struttu­re bersaglio del cancerogeno in tutti i mammiferi nonchè il fatto che tutti i cancerogeni dimostratisi tali nelle ricerche epidemio­logiche sull'uomo si siano rivelati cancerogeni anche negli ani­mali sono gli argomenti per i quali una sostanza considerata can­cerogena per l'animale è ritenuta tale anche per l'uomo.

Per provare la cancerogenicità di una sostanza se ne sommi­nistrano dosi molto alte a gruppi di animali d'ambo i sessi di specie diverse, ciascuno di cento individui. In prevalenza si ado­perano topi e ratti. Il trattamento dura per quasi tutta la vita dell'animale da poco dopo la nascita. La dose più alta è quella che non da fenomeni tossici rilevati da un rallentamento della cresci­ta rispetto ai controlli. Le altre dosi sono frazioni della dose più alta. Tutti gli animali che muoiono nel corso dell'esperimento vengono sottoposti ad un accurato esame necroscopico di tutti gli organi; i superstiti alla fine dell'esperimento vengono sacrifi­cati ed anch'essi esaminati. Si registrano tutti i tumori riscontrati e si comparano i vari gruppi con il gruppo di controllo. L'au­mento dell'incidenza dei tumori nei gruppi trattati (specialmente se proporzionale all'aumento della dose), il tipo e la sede del tu­more nonchè il tempo di latenza sono tutti elementi che vanno criticamente vagliati per giudicare non solo se una sostanza e cancerogena ma anche per avere un'idea della sua potenza onco­gena.

2.12 Dose e cancerogenesi.

Le variazioni metaboliche con l'aumento della dose del can­cerogeno sono un ricorrente luogo comune, però senza supporti sperimentali. Si ipotizza che, superando le capacità del sistema microsomico, i cancerogeni vengano metabolizzati diversamen­te. In realtà la distribuzione dei metaboliti di ossidazione di AAF, aflatossina, benzopirene ed altri idrocarburi policiclici non mostra alcuna variazione qualitativa e modeste variazioni quan­titative nei rapporti fra i vari metaboliti. Non esistono nell'orga­nismo enzimi diversi dai microsomici capaci di ossidare gli xe­nobiotici liposolubili, e l'unica conseguenza dell'aumento della dose, se la tossicita è bassa, è l'ovvio aumento della percentuale del cancerogeno non metabolizzato.

L'aumento della dose influenza invece molti altri fattori. Cambiano l'entità dell'assorbimento, dell'ossidazione e della co­niugazione e della reazione con il DNA: alle alte dosi la quantità somministrata non ha più un rapporto costante con quella assor­bita, con quella metabolizzata e con quella combinata con il DNA. Nelle prove su animali, aumentando la dose del cancero­geno aumenta l'incidenza di neoplasie ma, alle dosi più alte, il numero dei tumori non aumenta più e talora diminuisce, dato che una pane sempre maggiore della dose somministrata non viene ne assorbita ne metabolizzata; inoltre si manifestano feno­meni tossici che, abbreviando la durata della vita, impediscono ad alcuni tumori di manifestarsi.

Diminuendo la dose diminuisce il numero dei tumori fino ad azzerarsi per dosi di cancerogeno ancora lontane dallo zero. Ba­sta però aumentare il numero degli animali per osservare ancora tumori: questa "soglia apparente" è un esempio convincente del modesto potere analitico del metodo per studiare eventi statistici con gruppi troppo piccoli di animali rispetto alla frequenza del­l'evento.

Se si sceglie un altro approccio, mettendo in rappono l'au­mento della dose con il numero di mutazioni o trasformazioni ed il numero degli addotti nel DNA, si osserva per il benzopirene una linearità senza soglia per la Salmonella e per la trasforma­zione di cellule C3H 101/20 CL8, mentre per la trasformazione da virus SA7 in cellule di embrioni di criceto siriano vi è apparentemente una soglia intomo a 9 addotti per milione di nucleo­tidi. E’ evidente che la presenza del virus rende oltremodo com­plesso il procedimento di trasformazione cellulare (G. Theall et al. in: Banbury Report 13 "Indicators of Genotoxic Exposure". Ed. B.A. Bridges et al. (Cold Spring Harbor 1982) p. 231-240).

Se si determina semplicemente il numero degli addotti nel DNA in animali a cui si somministra per os il cancerogeno, si osserva che il numero di essi cresce linearmente con la dose an­che per valori molto bassi comparabili con l'esposizione umana. Per l'aflatossina si sono usate dosi fra 10 e 1000 ng/kg. Anche alla dose più bassa (che corrisponde a 0,7 µg per il peso di un uomo) si sono osservati legami con il DNA. Con l'aumento della dose il numero degli addotti aumentava linearmente: il valore del CBI restava costante ed il tipo di addotti era sempre lo stesso (B.S. Appleton et al. Cancer Res. 42, 3659-62 (1982)).

Analoga esperienza è stata fatta con il benzopirene variando però la dose di cinque ordini di grandezza, da 10 ng a 1 mg per ogni topo (da 0,5 µg a 50 mg/kg). Anche in questo caso il nume­ro degli addotti aumenta linearmente con l'aumento della dose senza alcuna indicazione di soglia (B.P. Dunn, Cancer Res. 43,2654-58 (1983)).

Questi risultati sono la conseguenza della bassa affinità degli enzimi microsomici e di coniugazione per il substrato e, come s'e detto sopra, della casuale distribuzione dei metaboliti dei cancerogeni fra enzimi, macromolecole e membrane. Mentre per l'aflatossina l'aumento della dose è stato limitato dalla sua forte epatotossicita, per il benzopirene, poco tossico, si sono potute raggiungere dosi comparabili a quelle alte utilizzate per le prove di cancerogenesi in animali.

Da questi esperimenti si possono trarre due conclusioni: in­nanzitutto si deve ritenere che anche alle dosi più basse esiste sempre una frazione del cancerogeno che reagisce con il DNA e vi è quindi un rischio, seppure piccolo, di cancerogenesi; inoltre appare giustificato affermare che le alte dosi impiegate nelle prove di cancerogenesi in animali sono , almeno per quanto ri­guarda la formazione di addotti con il DNA, linearmente estra­polabili alle basse dosi della esposizione umana (F. Toffoli, GL. Gatti, Boll. Chimici Lab. Provo 1 (26) (1) 99 (1975); GL. Gatti, F. Toffoli, ibidem 3 (28) (11) 309 (1977); GL. Gatti, F. Toffoli, Boll. Chim. Farmac.117, 64 (1978)).

2.13.A Vie di somministrazione dei cancerogeni

Fin dall'inizio della cancerogenesi sperimentale e stata data grande importanza alla via di somministrazione, cercando di uti­lizzare la stessa dell'esposizione umana e considerando quindi meno validi i risultati ottenuti per altre vie. Negli ultimi decenni il metabolismo e l'attivazione dei cancerogeni sono stati suffi­cientemente chiariti, con la dimostrazione che il sistema micro­somico è l'unico capace di attivare la maggior parte dei cance­rogeni. Questo sistema, come si è visto, è molto simile non solo in specie diverse, inclusi i vegetali, ma anche nei vari organi di uno stesso individuo, che presentano solo grandi differenze quantitative nel contenuto di enzimi microsomici.

Per i cancerogeni indiretti, che sono del resto i più numerosi, la via di somministrazione diviene quindi relativamente poco importante, dato che la sequenza generale dell'attivazione dei cancerogeni è rappresentata dal contatto, assorbimento nel san­gue, trasporto nelle cellule e metabolismo in esse, specie in quelle del fegato. Comparata all'inalazione, la spennellatura cu­tanea, ad esempio, significa solo dosi più basse se il canceroge­no, per essere attivato, dev'essere metabolizzato dal fegato. La via di somministrazione in questo caso non ha importanza pur­chè attraverso le varie vie si somministrino dosi uguali.

Mentre la fase ossidativa microsomica è molto simile nei va­ri organi, vi sono differenze piu o meno grandi per la coniuga­zione. L'influenza effettiva di queste differenze sulla canceroge­nesi va considerata su basi quantitative: se prevale in un certo organo un tipo di coniugazione che diminuisce la probabilità di cancerogenesi, ma quest'organo ha un centesimo dell'attivita microsomica epatica, questa differenza metabolica non avrà praticamente influenza sull'incidenza dei tumori.

In alcuni casi solo la via orale, rispetto alle altre, può deter­minare sensibili differenze nella cancerogenesi perchè possono avvenire, prima dell'assorbimento, reazioni chimiche o metabo­liche lungo il canale gastro-intestinale.

L'acidità gastrica può permettere particolari reazioni, come la formazione di nitrosammine. Ma le differenze principali con le altre vie di somministrazione sono dovute alla flora intestina­le. Bastera ricordare l'idrolisi di alcuni glucosidi di origine ve­getale, come la cicasina, necessaria per la formazione dell'agli­cone cancerogeno metilazossimetanolo [6.1]. La somministra­zione parentale della cicasina non è quindi cancerogena, per la mancanza nei mammiferi della idrolasi di questo glucoside.

Questa differenza fra le vie di somministrazione può essere sospettata già sulla base della natura chimica del composto e ri­chiede, nei test di cancerogenesi, se occorrono risposte non equi­voche sul ruolo della flora intestinale nell'attivazione dei cance­rogeni, l'uso di animali atimici.

2.13.B Farmacocinetica e compartimentazione

L'idrofobicità di molti cancerogeni e dei loro metaboliti ha un mole importante nella cancerogenesi, non solo per la distribu­zione delle membrane e per la reazione con il DNA nucleare ma perchè condiziona la distribuzione dei cancerogeni nell'organi­smo, la loro distribuzione all'interno della cellula e gli eventuali rapporti con i siti di combinazione.

La comparazione fra le radiazioni ionizzanti e la sommini­strazione o formazione dei perossidi, è un buon esempio dell'im­portanza dei compartimenti intercellulari. E’ noto infatti che, alle bassi dosi, l'azione diretta delle radiazioni è trascurabile, rispetto a quella indiretta dovuta alle specie reattive dell'ossigeno gene­rate dall'acqua e dall'ossigeno intercellulare. I più reattivi sono i radicali HO· : il passaggio della radiazione ionizzante li genera sia nel citoplasma che nel nucleo, ove, senza membrane da attra­versare, l'azione genotossica può esplicarsi direttamente sul DNA nucleare. Invece i perossidi assunti ad esempio con l'ali­mentazione non possono essere paragonati a quelli generati dalle radiazioni: infatti, oltre al percorso ematico, devono attraversare due membrane per esplicare l'azione genotossica. Nel sangue e nel citoplasma esistono poi efficienti enzimi capaci di decom­porre le specie reattive dell'ossigeno, in modo che il rischio can­cerogeno diretto dei perossidi alimentari può essere considerato praticamente trascurabile. Del resto anche la somministrazione di un proliferatore dei perossisomi come il dietilesilftalato [2.17], che generano direttamente nel citoplasma specie reattive dell'ossigeno, non producono alcun danno rilevabile al DNA nu­cleare (B.E. Butterworth et al., Carcinogenesis 5, 1329 (1984)).

I perossidi sono inattivati da catalasi e perossidasi, gli ioni su­perossido dalla superossidodismutasi e non passano le membra­ne biologiche per la carica. I radicali piu reattivi, gli HO·, non sono inattivati da nessun enzima, ma la loro semivita e brevissi­ma, possono percorrere pochi diametri, cioè non riescono ad at­traversare una membrana. Questo dato sembra in contraddizione con le rotture del ss-DNA indotte in vitro da neutrofili attivati (E. Schacter et al., Carcinogenesis 9, 2297 (1988)).

Ma i neutrofili, oltre alle comuni specie reattive dell'ossigeno, generano anche un ossidante energico e relativamente stabile, lo ione ipoclorito. Le specie reattive dell'ossigeno possono però in­direttamente aumentare il rischio cancerogeno ove siano presenti quantità anche piccole di cancerogeni. Questi possono essere at­tivati per ossidazione, in modo non coordinato con gli enzimi della fase 2, e raggiungere il nucleo e il DNA attraverso i mec­canismi gia descritti.

Un esempio dell'importanza della farmacocinetica nel deter­minare un rischio cancerogeno e offerto dai residui di ormoni naturali steroidi nelle carni degli animali di allevamento. La quantità di questi ormoni assumibili con la dieta è una frazione di quelli che si trovano naturalmente nel nostro organismo. Su questo rapporto quantitativo si è concluso sulla loro innocuità da parte delle agenzie pubbliche statunitensi. Tuttavia, mentre fino a pochi anni fa l'attività cancerogena degli ormoni era attribuita esclusivamente alla loro attività ormonale, si è visto che essi possono venire anche epossidati dai sistemi microsomici, e for­mare addotti suI DNA [2.14.B]. Mentre gli ormoni endogeni vengono prodotti, trasportati e immessi selettivamente nelle cel­lule bersaglio, gli steroidi assunti con gli alimenti pervengono con la vena porta al fegato che li ossida e coniuga per la loro eli­minazione. La situazione è quindi completamente diversa da quella degli steroidi endogeni, mentre la semplice comparazione quantitativa non tiene conto delle differenze fra le due situazio­ni.

Le situazioni determinate dai rapporti con i siti di combina­zione enzimatici sono ben illustrati dall'esempio dell’acetaldeide. Questa è risultata un cancerogeno diretto (A.J. Saladino, Cancer Res. 45, 2522 (1985)), e come tale sta venendo regolata negli ambienti di lavoro. L'obiezione a queste misure è basata sulla presenza nell'organismo di quantità an­che rilevanti di acetaldeide provenienti dall'etanolo alimentare, che possono superare quelle respirate in ambiente di lavoro. Tut­tavia l'acetaldeide metabolica si forma sulla molecola dell'al­cooldeidrogenasi e passa su quella dell'aldeideossidasi, in modo che la concentrazione allo stato libero è estremamente bassa: ca­so analogo a quello di altri metaboliti. L'acido fumarico, ad e­sempio, ha una modesta tossicità (DL50 120 mg/kg) , ma se si ca1cola la quantità di questo metabolita costantemente presente nel nostro organismo, si dovrebbero manifestare i sintomi tossici da acido fumarico. Questo non avviene perchè tutto l'acido fu­marico si trova segregato all'interno dei mitocondri, distribuito fra i siti attivi della succinato deidrogenasi e della fumarasi.

In conclusione la comparazione meramente quantitativa fra situazioni diverse, usata come base per comparazione di rischio, spesso non è giustificata: accanto ai dati della tossicità e della genotossicita lo studio approfondito della farmacocinetica e del metabolismo delle sostanze diviene sempre più indispensabile.

2.14.A Modulazione della cancerogenesi

La somministrazione di una certa dose di AAF provoca negli animali un certo numero di tumori. Questi aumentano nel gruppo in cui i sistemi microsomici sono stati indotti con il  fenobar­bitale mentre diminuiscono se per l'induzione è stato usato il metilcolantrene. Ciò avviene perchè mentre il citocromo P-450 lega l'AAF e ne idrossila l'azoto, il citocromo P-448, indotto dal metilcolantrene, lega ugualmente l'AAF ma ne idrossila un anello­ aromatico. Dato che solo il derivato N-idrossilato è capace di reagire con il DNA [cap. 8, 9 e 10], i tumori aumentano se, con il fenobarbitale, si è indotto il citocromo P-450 mentre diminui­scono se, usando il metilcolantrene, si è indotto il citocromo P-448. Nell'esperimento l'induzione con il metilcolantrene può portare alla soppressione dell'attivita cancerogena dell'AAF. E’ un buon esempio dello scarso potere statistico dei saggi di cancerogenesi su animali dovuto al numero relativamente piccolo degli animali impiegati. Sarebbe quindi errato dire che, dopo l'induzione con metilcolantrene, l'AAF non è piu cancerogeno. Per la prevalenza quantitativa dell'indotto P-448 cambiano solo i rapporti fra l'AAF idrossilato nell'anello e quello N-idrossila­to. La bassa specificità dei siti idrofobici degli enzimi microso­mici fa si che anche a basse concentrazioni di AAF, lontane dal­la saturazione degli enzimi, esso si distribuisca fra le due for­me.

Quando si dice percio "non è cancerogeno", questa afferma­zione ha il senso relativo di: "non si riscontrano tumori nel gruppo di animali in esperimento". La modulazione metabolica determinata dall'induzione in questo caso riduce il rischio di cancerogenesi ma non loelimina.

Gli ormoni influenzano molto la cancerogenesi chimica ma un esempio basterà a dimostrare che prima di attribuire l'azione cancerogena di un ormone alla sua attività ormonale occorre molta cautela. Se si somministra etinilestradiolo (M. I. 3683) aumentano i tumori provocati dall'AAF mentre diminuiscono quelli provocati dal benzopirene. Questi dati sarebbero inspiegabili se si attribuisse la causa all'attività ormonale dell'etinile­stradiolo. Tutto diventa chiaro se si ricorda che la somministra­zione dell'etinilestradiolo porta ad una competizione fra l'or­mone ed i cancerogeni per i siti idrofobici del citocromo P-448. Con l'AAF si ha quindi una marcata inibizione dell'idrossilazio­ne degli anelli aromatici dell'AAF con conseguente aumento della N-idrossilazione, della reazione con il DNA e del numero dei tumori (R.H. Purdy, M.V. Marshall, Carcinogenesis 5,1709-15 (1984)). Nel caso del benzopirene, ormone e canceroge­no competono per lo stesso sito dell'enzima; e poichè dall'ossi­dazione dell'ormone non vengono specie capaci di reagire con il DNA, diminuiscono gli epossidi del benzopirene e quindi i tu­mori.

2.14.B Cancerogenesi ormonale

La cancerogenicità degli ormoni steroidi è stata attribuita alla lora attività biologica. II chiarimento delle modalità d'azione or­monale degli steroidi, con la stimolazione della sintesi del DNA da parte dei loro complessi con i recettori citoplasmatici, hanno definitivamente codificato il meccanismo della cancerogenesi ormonale come un meccanismo indiretto, sostanzialmente epige­netico, che ha spesso alla base la proliferazione cellulare dipen­dente da questi ormoni (B.E. Henderson et al., Cancer Res. 48,246 (1988)).

Tuttavia negli ultimi anni si sono raccolte molte evidenze sul­la capacità degli ormoni steroidi di formare anche addotti con il DNA o di provocare alterazioni cromosomiche e di agire così con i classici meccanismi genotossici. Si è dovuto quindi con­cludere che l'effetto cancerogeno degli ormoni steroidi non è sempre correlato all'attività ormonale (C. Sumi et al., J. Nat. Cancer Inst. 73, 1229 (1984)). Anche gli effetti em­briotossici dell’estradiolo sono dovuti a suoi metaboliti reattivi formati dal citocromo P-450 (B.K. Beyer, M.R. Juchau, Biochem. Biophys. Res. Comm. 145, 402 (1987)). Si è visto poi che l'effetto fa­vorente dell'etinilestradiolo sull'induzione di enzimi microsomi­ci da metilcolantrene non è mediato dai recettori degli estrogeni. Inoltre sia lo steroide che il metilcolantrene inducono gli stessi isozimi dei citocromi P-450 (S.A. Sundstrom et al., Biochem. Pharmacol. 37, 1003 (1988)). La dimostrazione più convin­cente del ruolo predominante dei metaboliti genotossici degli estrogeni nella cancerogenesi da questi ormoni è offerta dalla comparazione della cancerogenesi in vivo fra estradiolo e 2fluoroestradiolo. Benchè quest'ultimo abbia un'attività ormonale superiore a quella dell'estradiolo, solo il primo e risultato cance­rogeno (J.G. Liehr, Arch. Toxicol. 55, 119 (1984)). L'alogenoderivato viene idrossilato al posto del fluoro mentre l'ormone naturale privo del punto di attacco reatti­vo viene inizialmente epossidato ed è così capace di reagire con il DNA.

L'attività ormonale può però concorrere alla cancerogenesi. La somministrazione di tamossifene [11.5] ai criceti trattati con estrogeni che inducono tumori renali diminuisce questi tumori senza che diminuisca parallelamente il numero degli addotti de­gli estrogeni sul DNA (J.G. Liehr et al. Cancer Res. 48, 779 (1988)).

Va infine citato un lavoro nel quale si è osservato che la somministrazione di diversi estrogeni di sintesi provoca sul DNA la comparsa dello stesso addotto che si forma somministrando l’or­mone naturale. Data la differenza chimica fra estradiolo e stilbe­strolo, sembra che l'aumento della concentrazione degli ormoni provochi un aumento del numero degli addotti degli steroidi na­turali, gli unici costantemente presenti in tutti gli esperimenti (J.G.Liehr et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 83, 5301 (1986)).

2.15 Cancerogeni diretti

Sono così definiti quei cancerogeni che non hanno bisogno per la loro azione di una trasformazione metabolica perchè sono essi stessi reattivi.

Perchè alcune molecole del cancerogeno diretto possano rag­giungere il DNA nucleare e modificarlo occorrono concentrazio­ni relativamente elevate; infatti la sostanza dovrà prima attraver­sare il liquido extracellulare, le membrane cellulari, il citopla­sma e le membrane nucleari, tutte strutture con cui avrà la pos­sibilità di reagire. Pertanto, per i cancerogeni diretti il numero dei tumori non è funzione lineare della dose come per quelli in­diretti ma è una funzione esponenziale. Per uno dei più diffusi cancerogeni diretti, la formaldeide [13.1, 13.5] gli esperimenti sui animali hanno dimostrato che il numero dei tumori cresce con la terza potenza circa della dose. Con alte dosi di canceroge­ni diretti si può ottenere un'incidenza di tumori sul 100% degli animali, risultato praticamente irraggiungibile con cancerogeni medi o deboli; diminuendo la dose diminuisce rapidamente l'in­cidenza dei tumori. Queste considerazioni hanno grande impor­tanza nelle stime di rischio determinate da tracce di cancerogeni diretti nell'ambiente di lavoro o negli alimenti.

Bisogna poi ricordare che vi possono essere effetti collaterali dei cancerogeni diretti legati alla loro elevata reattività: si può avere la formazione di radicali liberi o di perossidi o di forme at­tive dell'ossigeno molecolare [5.5]. Si spiegano così alcune azio­ni sinergiche fra cancerogeni diretti ed indiretti.

2.16 Cancerogeni epigenetici

E’ stato da tempo dimostrato che alcune sostanze, certamente incapaci di reagire con il DNA e che conseguentemente non risultano mutagene in nessuno dei test di mutagenesi finora usati, sono capaci di indurre tumori. Poichè queste sostanze sono risul­tate certamente anche non promotrici, non si è riusciti a formula­re una ipotesi soddisfacente sul meccanismo molecolare di que­sto tipo di cancerogenesi: tuttavia si considera che il fenomeno esista.

Queste affermazioni hanno portato alla formulazione del con­cetto di "cancerogenesi epigenetica", non legata quindi all'alterazione del DNA.

L'esistenza di cancerogeni epigenetici avrebbe importanti im­plicazioni pratiche: per questo tipo di xenobiotici deve esistere una soglia molto più alta della bassissima soglia dei cancerogeni "genotossici". Dal punto di vista normativo dovrebbero essere considerati e regolati in modo differente dagli altri cancerogeni. Per essi si potrebbe determinare, con i criteri della tossicologia classica, il "no effect level" e prescrivere ADI, TVL, ecc.

Tuttavia nell'ultirno decennio i miglioramenti dei metodi del­la chimica analitica di tracce di sostanze organiche hanno per­messo indagini ambientali che hanno dimostrato la presenza ubi­quitaria di piccole quantità di cancerogeni, specialmente appar­tenenti agli idrocarburi aromatici policiclici, agli alogenoderivati aromatici e aIle micotossine, trascurando i precursori delle nitro­sammine come nitrati e nitriti. Le aflatossine, ad esempio, sono state identificate nelle diete per animali da laboratorio, mettendo seriamente in dubbio l'esistenza di tumori "spontanei", che sa­rebbero invece l'espressione di una maggior sensibilità alla can­cerogenesi chimica di particolari ceppi di roditori.

Non si può quindi essere certi dell'esistenza di cancerogeni epigenetici. La universale diffusione ambientale di minute quantità di cancerogeni genotossici e gli effetti di sostanze cocancerogene capaci di aumentare di parecchi ordini di grandezza il potere cancerogeno possono spiegare la cancerogenesi "epige­netica" come una cancerogenesi da basse dosi di cancerogeni genotossici potenziate da concentrazioni relativamente elevate di cocancerogeni.

Allo stato attuale delle conoscenze non si può giungere ad una soluzione definitiva del problema: occorrono molte ricerche sperimentali di cancerogenesi animale nelle quali i controlli sa­ranno critici (dovranno essere cioè con eccezionale cura critica­mente studiati).

Tuttavia anche se il concetto di cancerogenesi epigenetica do­vesse scomparire non vi sarebbero conseguenze pratiche nella regolazione. Infatti gli attuali cancerogeni epigenetici verrebbero considerati come cocancerogeni che per esercitare la loro azione devono raggiungere concentrazioni capaci di provocare quelle alterazioni biochimiche e strutturali che facilitano la trasforma­zione neoplastica. Per essi quindi si possono determinare e fissa­re valori di soglia e quindi i limiti accettabili.

2.17. Meccanismi indiretti di cancerogenesi chimica

2.17.1. Introduzione

Fra le sostanze non iniziatrici, e non promotrici o cocancero­gene, che tuttavia inducono aumento dell'incidenza dei tumori si riportano come esempi la diossina (D) (TCDD, M. I. 8957) e il dietilesilftalato (DEHP) (M.I. 1248). Sperimentalmente queste sostanze, anche se somministrate da sole, determinano un au­mento dell'incidenza dei tumori "spontanei" negli animali ma il loro effetto e più evidente se associate a dosi anche piccolissime di cancerogeni. A dosi del cancerogeno così basse da non provo­care normalmente tumori nel gruppo in esperimento, si ha un'e­levata incidenza di neoplasie dello stesso tipo di quelle indotte dal cancerogeno a dosi più alte.

2.17.2. Diossina

La diossina, prodotto secondario della preparazione del tri­clorofenolo e protagonista dell'episodio tossico di Seveso (10 luglio 1976), è il più potente induttore conosciuto di enzimi mi­crosomici della fase ossidativa mentre non induce epossidoidra­tasi e coniugasi. Come induttore è 30.000 volte più potente del metilcolantrene e, analogamente ad altri alogenorganici, induce tutte le forme del citocromo P-450. E' capace di induzione anche in ceppi di roditori geneticamente non inducibili e quindi anche in tessuti dove di solito è scarsa o assente l'attivita ossidativa mi­crosomica.

Questa è la base biologica dell'azione cancerogena indiretta della D: i cancerogeni presenti in tracce o somministrati vengo­no ossidati con alta resa mentre la coniugazione resta ridotta. Una frazione più grande delle specie attivate del cancerogeno o dei cancerogeni si distribuisce così sulle superfici biologiche e può raggiungere il DNA. Nel caso della diossina a questo effet­to si aggiunge l'altissima tossicità generale della sostanza che in­duce sofferenza epatica e iperplasia reattiva con aumento delle divisioni cellulari negli epatociti che facilita l'induzione di epa­tomi.

2.17.3. Dietilesilftalato

L'effetto biologico più rilevante del di-(2-etilesil)ftalato (DHEP, M.I. 1248), plastificante usato anche nelle pompe per vuoto, è l'induzione di perossisomi (gliossisomi, microbodies) accompagnata da iperplasia epatica e abbassamento della con­centrazione dei lipidi plasmatici.  I perossisomi contengono cata­lasi (che costituisce un terzo delle proteine perossisomiche), os­sidasi flaviniche, che generano H2O2 ed enzimi del metaboli­smo lipidico come enoil-CoA idratasi e acil-CoA sintetasi.

L'induzione dei tumori è mediata da un duplice meccanismo:

1) generazione di perossidi ed azione di questi sul DNA;

2) a­zione ossidativa, indipendente da quella microsomica, su altri cancerogeni presenti, particolarmente efficace per la genotossicità a causa dell'assenza di coordinazione con gli enzimi della seconda fase, quella coniugativa.

2.17.4. Discussione

L'osservazione che per lo stesso ceppo di animali da laborato­rio l'incidenza dei tumori "spontanei" variava da un istituto al­l'altro e la dimostrazione della presenza in varie partite di man­gimi commerciali per roditori di piccole quantità di aflatossine, derivanti dall'uso di panelli di arachidi o di farine di mais nella preparazione dei mangimi, ha messo fortemente in dubbio la "spontaneità" dei tumori. Il fattore genetico sembra avere impor­tanza nello sviluppo dei tumori, "determinati" però dalla presen­za ambientale di piccole quantità di cancerogeni diversi. Simil­mente è stato dimostrato che la pretesa cancerogenicità del virus dell'epatite B è dovuta ad un effetto indiretto: i tumori epatici, anche in questo caso, sarebbero provocati da cancerogeni am­bientali (M. Melbye et al. J. Nat. Cancer Inst. 73, 1267 (1984)).

I fattori indiretti di cancerogenesi sono per la D l'incremento per induzione della concentrazione degli enzimi microsomici ossidativi e per il DEHP l'induzione di perossisomi con conse­guente produzione di specie attivate dell'ossigeno [5,3; 5,5]. Nel primo caso le ossidasi microsomiche attivano le piccole quantità di cancerogeni ambientali. Nel secondo caso possono avvenire analoghe reazioni provocate dalle specie attivate dell'ossigeno; in più queste ultime possono reagire direttamente con il DNA. Ma questo tipo di danno è più rapidamente e facilmente ripara­bile perche sono da sostituire segmenti di DNA molto più brevi di quelli interessati da addotti ingombranti come gli idrocarburi policiclici o le ammine aromatiche; inoltre le varie specie attiva­te dell'ossigeno vengono rapidamente inattivate da vari enzimi ubiquitari.

Il rischio oncogeno da D e da DEHP dipende quindi in gran parte dalla presenza di quantità anche minime di cancerogeni; in assenza di questi non si avrebbero tumori da D e si ridurrebbero drasticamente quelli da DEHP.

La situazione ambientale specialmente nei Paesi industrializzati, determina invece un contat­to continuo con piccole quantità di cancerogeni diversissimi (ad esempio dalla sola aria urbana assorbiamo circa 0,1 µg di idro­carburi aromatici policiclici al giorno) in modo che sostanze co­me D e DEHP, sicuramente non genotossiche, rappresentano un reale rischio oncogeno, sia pure attraverso i complessi meccani­smi indiretti che sono stati esposti.

La mancanza di un'azione cancerogena diretta della diossinaè stata confermata epidemiologicamente a distanza di 10 an­ni dall'incidente di Seveso. Gli esperti che hanno esaminato i più clamorosi casi di esposizione alla D, Seveso compreso, sono del parere che "dosi inferiori a quella necessaria per provocare la cloracne non dovrebbero avere conseguenze neppure a lungo termine" (American Council on Science and Health. Report 1995. A. Fellman: "Dioxin in the environment: its effect on human health. Da: L. Malatesta. Chimica Industria 67 (5) 245 (1985)). In effetti, mentre l'esposizione alla D può essere associata a rischi teratogeni e mutageni su animali di laborato­rio, gli studi sull'uomo e le recenti ricerche sulle conseguenze ri­tardate dell'episodio di Seveso non hanno evidenziato nessuno di tali effetti, confermando così indirettamente la distinzione fra le due azioni: di "inizio" e di "promozione" [17.3] (P. Mocarelli et.al., JAMA Italia 4 (2) 145 (1987); P. Mastroiacovo et. aI., JAMA 259 (11) 1668 (1988)).

Non sarà mai abbastanza criticata l'abitudine antiscientifica, che purtroppo si va sempre più diffondendo, di dedurre un mec­canismo "epigenetico" di cancerogenesi ove manchino gli addot­ti con il DNA della sostanza ritenuta oncogena. In primo luogo perchè la formazione di addotti con il DNA non è il solo mecca­nismo genotossico: tali sono anche i danni cromosomici, di­sgiunzionali e le aneuploidie. In secondo luogo perchè nel caso del DEHP il meccanismo è indubbiamente genotossico, sia pure indiretto. Si può dire che il DEHP è cancerogeno nello stesso senso che sono "mutageni" i leucociti per la loro capacità di pro­durre e liberare specie attivate dell'ossigeno, impiegate in vivo come strumento della loro attività biologica normale.

2.18. Differenze fra tossicità e genotossicità

La prima ed essenziale differenza fra le sostanze tossiche e genotossiche è che, mentre qualunque sostanza, nessuna esclusa, può diventare tossica con l'aumento della dose, nessuna sostanza che non sia genotossica può diventarlo con l'aumento della dose, dato che la genotossicità richiede la possibilita di reagire con il DNA, e ciò dipende esclusivamente dalla struttura chimica del composto [1.2.2]. Questa differenza fondamentale è spesso di­menticata anche dai tossicologi.

Per effetto tossico di una sostanza chimica s'intende qualun­que alterazione che determini danni funzionali, strutturali e/o la stessa morte cellulare. Effetti tossici si hanno quindi a qualsiasi dose perchè, per quanto piccola, un certo numero, anch'esso molto piccolo, di cellule può venir danneggiato dal contatto col tossico. Tuttavia questo minimo danno non è rilevabile non solo sintomatologicamente ma neppure con le piu sensibili metodiche di indagine biochimica. Bisogna infatti che siano danneggiate o uccise almeno migliaia di cellule, ad esempio epatiche, perchè sia rilevabile biochimicamente il danno, e probabilmente devono essere danneggiati milioni di cellule perchè si abbiano sintomi clinicamente rilevabili [7.5]. Esiste quindi per ogni sostanza tos­sica una "soglia" al di sotto della quale non è possibile rilevare in alcun modo un effetto tossico [1.2.1].

La massima dose senza effetti rilevabili è chiamata "no effect level". Questa dose determinata sugli animali viene poi estrapo­lata all'uomo utilizzando un fattore di sicurezza che di solito è 100. Questo fattore è applicato per evitare l'effetto di fenomeni di accumulo nel caso di tossici che si eliminano con difficoltà, di interazioni per esposizione simultanea ad altri tossici e per tener conto delle differenze di specie e individuali di suscettibilità agli effetti tossici e della presenza nella popolazione di vecchi, bam­bini, malati e gestanti. Il "no effect level" diviso per 100 si può applicare come dose minima permissibile per l'uomo.

Caratteristica dell'azione tossica, oltre la presenza della so­glia, è l'aumento della frequenza (nella popolazione) e dell'inten­sità dei fenomeni tossici con l'aumento della dose. Inoltre passa un tempo piuttosto breve fra l'inizio dell'esposizione e la com­parsa degli effetti tossici. Alla sospensione dell'esposizione se­gue l'attenuarsi e la progressiva scomparsa dei fenomeni tossici, con il ripristino delle condizioni di salute iniziali. La tossicità è quindi, specialmente se lieve o iniziale, un fenomeno reversibile [1.2.1].

Per gli agenti genotossici, di cui fanno parte i cancerogeni, la situazione è molto diversa: intanto non esiste soglia. Con l'au­mentare della dose aumenta la frequenza (più individui colpiti) ma non l'intensità: il tumore provocato da dosi bassissime è u­guale a quello provocato da alte dosi di cancerogeno. La sospen­sione dell'esposizione non influisce sullo sviluppo del tumore, che è irreversibile. Il periodo di latenza è poi lunghissimo, da 10 a 40 anni dall'inizio dell'esposizione, tanto che moltissimi tumo­ri sono diagnosticati quando l'esposizione che li ha provocati è gia cessata da anni. Si tratta di differenze così profonde da ren­dere impossibile l'applicazione ai cancerogeni degli schemi im­piegati per le sostanze tossiche e quindi la fissazione di livelli, dosi e concentrazioni di sicurezza. Le concentrazioni soglia dei cancerogeni sono cosi basse da esser vicine allo zero analitico.

Infine, mentre per i tossici, a parte i casi ben noti di sinergi­smo, le azioni tossiche di due di essi, anche se somministrati contemporaneamente, di solito sono indipendenti, nel caso dei cancerogeni l'interazione è la regola e spesso gli effetti non si sommano ma si esaltano. E dato che la condizione più diffusa per la popolazione dei Paesi industrializzati è l'esposizione a pic­cole quantità di un gran numero di cancerogeni diversi, l'aumen­to anche modesto di questo carico, anche per un solo canceroge­no, può avere conseguenze superiori a quelle prevedibili dagli e­sperimenti su animali nei quali si ha l'esposizione ad un solo cancerogeno. A questo si deve aggiungere la possibilità di effetti cocancerogeni da parte di numerose sostanze del tutto prive di attività genotossica e quindi cancerogena ma capaci di potenzia­re anche migliaia di volte la cancerogenicità dei composti geno­tossici.

Per tutte queste considerazioni si deve ammettere che per un cancerogeno l’unica concentrazione priva di rischio sia lo zero.

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